Keywords：T細胞活化擴增；CD3/CD28抗體偶聯(lián)磁珠；IL-2；T細胞擴增培養(yǎng)基；CD3+ T；CD4+ T;CD8+ T；小鼠免疫試驗；T cell activation and expansion;Anti-CD3/CD28 antibody-conjugated magnetic beads; T Cell Expansion Medium; Cell Therapy；Mouse immunological experiments;

在基礎(chǔ)免疫學研究、腫瘤免疫模型構(gòu)建、CAR-T細胞療法臨床前研究等領(lǐng)域，小鼠是常見的體外模型。其中，小鼠T細胞作為核心研究對象，其體外高效活化與擴增是實驗成功的關(guān)鍵前提。小鼠T細胞與人類T細胞具有同源性，其活化同樣遵循“三信號機制"，但因種屬特異性差異，對活化試劑、培養(yǎng)條件的適配性要求更為嚴苛。IPHASE作為體外研究生物試劑引-領(lǐng)者，依托多年細胞培養(yǎng)技術(shù)積累，針對小鼠T細胞特性優(yōu)化開發(fā)了包括CD3/CD28抗體偶聯(lián)磁珠在內(nèi)的全套活化擴增試劑，結(jié)合標準化實驗流程與常見問題解決方案，為小鼠CD3/CD28介導的T細胞活化擴增提供高效、穩(wěn)定、可重復的一站式解決方案，助力科研工作者高效推進實驗進程。

01    小鼠T細胞活化擴增的“三信號機制"

T細胞活化擴增的“三信號機制"是免疫學中的核心概念，它詳細描述了初始T細胞被完-全激活并增殖為效應(yīng)細胞所必需的三種協(xié)同信號。缺少其中任何一個信號，都將導致T細胞失能、凋亡或僅產(chǎn)生微弱反應(yīng)。

小鼠T細胞的完-全活化需依賴“三信號協(xié)同作用"，缺少任一信號均會導致T細胞失能、凋亡或增殖微弱，這一機制與人類T細胞活化原理一致，但需適配小鼠細胞的種屬特異性：

1. 第一信號（抗原特異性信號）：由小鼠T細胞表面TCR-CD3復合物與抗原呈遞細胞（APC）表面MHC-抗原肽復合物結(jié)合產(chǎn)生，是T細胞活化的“啟動信號"，需通過抗小鼠CD3抗體特異性結(jié)合TCR-CD3復合物觸發(fā)。

2. 第二信號（共刺激信號）：由小鼠T細胞表面CD28分子與APC表面B7配體結(jié)合產(chǎn)生，是避免T細胞“免疫無能"、維持活化持續(xù)推進的關(guān)鍵，需通過抗小鼠CD28抗體提供協(xié)同刺激。

3. 第三信號（增殖存活信號）：以IL-2（白細胞介素-2）為核心，作為關(guān)鍵細胞因子，其可特異性結(jié)合小鼠T細胞表面IL-2受體，激活下游JAK-STAT信號通路，推動T細胞從G0靜息期進入細胞周期，實現(xiàn)大量增殖的同時，維持細胞活性與功能穩(wěn)定性，促進其分化為效應(yīng)T細胞或記憶T細胞，是小鼠T細胞擴增的“能量核心"。

其中，CD3/CD28抗體偶聯(lián)磁珠是模擬體內(nèi)APC功能的最-優(yōu)工具，其通過模擬天然APC的粒徑與立體結(jié)構(gòu)，可與小鼠T細胞形成類免疫突觸的高效結(jié)合模式，實現(xiàn)更均勻、高效的活化效果，顯-著優(yōu)于傳統(tǒng)平板包被法，且磁珠的超順磁性特性便于后續(xù)分離去除，不干擾后續(xù)實驗（如流式檢測、細胞功能實驗等）。同時，針對小鼠T細胞的特性，抗小鼠CD3/CD28抗體經(jīng)過特殊處理，確保對細胞的直接刺激活性，避免有害成分干擾細胞功能。

02    小鼠CD3/CD28磁珠介導的T細胞活化擴增標準化流程

IPHASE作為體外研究生物試劑引-領(lǐng)者，為滿足基礎(chǔ)免疫學研究、腫瘤免疫模型構(gòu)建、CAR-T細胞療法臨床前研究等領(lǐng)域的快速發(fā)展需求，已開發(fā)、生產(chǎn)了小鼠T細胞活化擴增所需的培養(yǎng)基（T Cell Expansion Medium）與小鼠CD3/CD28 T細胞活化擴增磁珠（Anti-CD3/CD28 antibody-conjugated magnetic beads）等相關(guān)試劑。同時，為驗證試劑的適用性，IPHASE技術(shù)人員使用IPHASE Mouse PBMC Isolation Kit （Cat.：071E100.11），從空白小鼠的全血中分離得到外周血單個核細胞（PBMC），后使用 IPHASE Mouse CD3/CD28TCells Activation/ Expansion Beads進行 CD3+ T 細胞的擴增。 具體流程及結(jié)果如下：

①將 IPHASE Mouse CD3/CD28 T Cells Activation/Expansion Beads 渦旋混勻。

②向PBMC中添加一半數(shù)量的 IPHASE Mouse CD3/CD28 T Cells Activation/ Expansion Beads,如 2x106個 PBMC添加 25μL 的 IPHASE Mouse CD3/CD28 T Cells Activation/Expansion Beads .

③350g 離心 5min，去掉上清液，以含 200IU/mL 的 IL-2 的 Mouse T Cell Expansion Medium 重懸細胞并調(diào)整細胞密度至 2×106cells/mL，轉(zhuǎn)至培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。

④激活后第 1 天不做處理，第 2 天補充與第 0 天等體積的含 200IU/mL 的 IL-2 的 Mouse T Cell Expansion Medium 培養(yǎng)基，于第 3 天使用磁力架移除磁珠，按照 0.5-1×106cells/mL 的密度繼續(xù)在含 1000IU/mL 的 IL-2 的 Mouse T Cell Expansion Medium 中進行擴增培養(yǎng)。

⑤每日觀察培養(yǎng)物，記錄細胞大小和形態(tài)特征。當細胞培養(yǎng)物出現(xiàn)耗竭時，通常會觀察到細 胞收縮和增殖速率下降的現(xiàn)象。

上圖為按照如上操作得到的小鼠CD3+T細胞活化擴增結(jié)果圖。IPHASE技術(shù)人員以300萬PBMC為初始細胞，由圖左清晰可知，13天時，小鼠CD3+T細胞擴增倍數(shù)高達322倍；且為驗證T細胞的純度，圖右為擴增第九天時IPHASE技術(shù)人員使用了CD3+T和CD8+T細胞雙陽抗體流式驗證，純度可達95%。說明IPHASE小鼠T細胞活化擴增相關(guān)試劑具有良好的市場競爭力，值得客戶購買！

03    小鼠T細胞活化擴增常見問題及解決方案

小鼠T細胞活化擴增是基礎(chǔ)免疫學研究、腫瘤免疫模型構(gòu)建等領(lǐng)域的常規(guī)實驗操作，應(yīng)用廣泛且流程日趨成熟，但在實際實操過程中，仍會因樣本處理、試劑使用、培養(yǎng)條件等多種因素出現(xiàn)各類問題，影響實驗效率與結(jié)果可靠性，以下結(jié)合實操經(jīng)驗，梳理常見問題并給出針對性解決方案，助力科研工作者高效推進實驗。

Q1：T細胞活化效率低，無明顯增殖的原因是什么？

常見原因：

①CD3/CD28磁珠與細胞比例不當（磁珠過多/過少）；

②IL-2濃度不足或失效（IL-2需低溫保存，反復凍融易失效）；

③培養(yǎng)基營養(yǎng)不足或未適配小鼠T細胞；

④細胞初始活率過低（<85%）；

⑤孵育溫度、CO?濃度異常；

⑥磁珠與細胞孵育時間不足。

解決方案：

①調(diào)整磁珠與細胞比例至1:1（小鼠T細胞最-優(yōu)比例，避免磁珠過多抑制細胞活力），孵育時間適當延長，確保磁珠與細胞充分結(jié)合；

②IL-2需-20℃避光保存，避免反復凍融，使用前快速復溶，配制后立即使用，活化階段終濃度200IU/mL，擴增階段1000IU/mL；

③更換IPHASE小鼠專用T細胞擴增培養(yǎng)基，添加專用培養(yǎng)基組分，補充特異性營養(yǎng)因子；

④分選前篩選活率≥85%的PBMC，可使用死細胞去除磁珠去除死細胞；

⑤嚴格控制培養(yǎng)條件：37℃、5% CO?，飽和濕度，避免溫度波動；

⑥若活化后細胞無明顯增殖，可補充少量新鮮IL-2，延長擴增周期1-2天。

Q2：擴增過程中細胞活率持續(xù)下降？

常見原因：

①細胞密度過高，代謝廢物堆積；

②培養(yǎng)基更換不及時，營養(yǎng)耗盡；

③IL-2濃度過高，產(chǎn)生毒性；

④磁珠未及時移除，持續(xù)刺激導致細胞耗竭；

⑤培養(yǎng)環(huán)境被污染（細菌、真菌）；

⑥細胞分選過程中損傷嚴重。

解決方案：

①每日監(jiān)測細胞密度，當密度超過2×10?cells/mL時，及時稀釋；

②每3天更換1次新鮮完-全培養(yǎng)基，及時去除代謝廢物；

③調(diào)整IL-2濃度，擴增階段不超過1000IU/mL，避免毒性作用；

④活化后第3天及時用磁力架移除磁珠，操作輕柔，避免損傷細胞；

⑤嚴格執(zhí)行無菌操作，培養(yǎng)器材高壓滅菌，培養(yǎng)基使用前檢測有無污染，若發(fā)現(xiàn)污染，立即終止培養(yǎng)，更換試劑重新實驗；

⑥分選過程中動作輕柔，避免反復吹打細胞，離心速度不超過350g，減少細胞損傷。

Q3：不同批次實驗結(jié)果差異大，可重復性差？

常見原因：

①小鼠個體差異（年齡、體重、健康狀況不同）；

②試劑批次差異，未進行批次驗證；

③實驗操作不規(guī)范（孵育時間、溫度、離心速度不一致）；

④培養(yǎng)基配制不規(guī)范，IL-2濃度不準確；

⑤分選條件不統(tǒng)一。

解決方案：

①選用同品系、同年齡（6-8周齡）、體重相近的健康小鼠，每組實驗至少3只，減少個體差異；

②使用IPHASE同一批次試劑，實驗前對試劑進行活性驗證；

③嚴格遵循標準化流程，固定孵育時間、溫度、離心速度等參數(shù)，分選緩沖液、培養(yǎng)基配制嚴格按比例操作，做好實驗記錄；

④IL-2配制后立即使用，避免放置時間過長導致活性下降；

⑤統(tǒng)一分選策略（如均采用陰選法）和分選柱型號，確保分選條件一致。

04    IPHASE產(chǎn)品

綜上所述，小鼠T細胞活化擴增實驗應(yīng)用廣泛且流程日趨成熟，但仍有較多試驗問題亟待解決。鑒于此，IPHASE作為體外研究生物試劑引-領(lǐng)者，研發(fā)、生產(chǎn)了高質(zhì)量小鼠T細胞活化擴增相關(guān)試劑，包含小鼠CD3/CD28 T細胞活化擴增磁珠（Anti-CD3/CD28 antibody-conjugated magnetic beads）、T細胞擴增培養(yǎng)基（T Cell Expansion Medium）及重組IL-2等產(chǎn)品，是科研人員的不二-選擇！

除小鼠T細胞活化擴增相關(guān)試劑外，IPHASE技術(shù)人員也開發(fā)出人T細胞活化擴增及全套免疫細胞相關(guān)試劑，為客戶的細胞治療研究提供一站式服務(wù)！產(chǎn)品列表如下：

IPHASE生產(chǎn)產(chǎn)品均具有以下優(yōu)勢：

 合規(guī)性 生產(chǎn)產(chǎn)品的組織均由正規(guī)渠道獲得，來源清晰。

 安全性 生產(chǎn)組織均經(jīng)過病原檢測，保證產(chǎn)品質(zhì)量安全。

 高質(zhì)量 生產(chǎn)產(chǎn)品均經(jīng)過嚴格的內(nèi)部質(zhì)控，且同批次數(shù)量多，批次間差異性小。

 可定制 可根據(jù)客戶特殊需求，提供定制服務(wù)。